原创:基金会中国出生缺陷干预救助基金会8月3日2018年7月31日,出生缺陷(遗传代谢病)救助项目工作推进会暨管理培训班在京举办,中央广播电视总台新闻联播进行了报道。简单来说这个会议总结了近几年来出生缺陷救助项目的进程,并且让大家撒花开心的是,2018年增加北京市、天津市、吉林省、黑龙江省、广东省、重庆市、云南省、西藏自治区、宁夏回族自治区等9个省(区、市),项目实施省份扩大到29个。并且,曾经申请过救助的孩子也可以申请第二次救助。越来越多的孩子能受到帮助,越来越多的家庭可以不再迷茫。
本文刊于:中华儿科杂志,2019,57(6): 494-496 作者:童凡 赵正言 单位:浙江大学医学院附属儿童医院 浙江省新生儿疾病筛查中心 摘要 新生儿疾病筛查属于三级预防的概念,通过新生儿筛查获得早期诊断、规范治疗的患儿预后获得极大改善。而正确解读新生儿筛查结果,是确保患儿获得及时诊治以及避免过度诊断造成社会、家庭资源浪费的重要保障。 一、新生儿疾病筛查(newborn screening,NBS)概念 NBS是指医疗保健机构在新生儿群体中,用快速、简便、敏感的检验方法,对一些危害儿童生命、导致儿童体格及智能发育障碍的先天性、遗传性疾病进行筛检,在患儿出现临床症状前作出早期诊断,结合有效治疗,避免患儿机体各器官出现不可逆损伤,保障儿童正常生长发育的一项系统保健服务[1]。 二、NBS病种纳入标准及趋势 1.NBS病种纳入标准: 1967年世界卫生组织制定了筛查病种的选择标准,经过50余年的筛查历程,国际上公认的标准为,(1)疾病危害严重,可致残或致死;(2)疾病发病率相对较高,且发病机制及异常产物已阐明;(3)疾病早期无特殊症状,但有实验室指标能显示阳性;(4)有准确可靠、适合在新生儿群体中进行大规模筛查的方法,假阳性及假阴性率均较低,并易为家长所接受;(5)已建立有效治疗方法,通过早期治疗能逆转或减慢疾病的发展或者改善其预后;(6)筛查费用、医学治疗效果及社会经济效益的比例合理。 2.NBS发展趋势: (1)随着串联质谱筛查技术及二代测序技术的发展和先天性、遗传性疾病机制、治疗研究的推进,NBS疾病谱不断扩大;(2)大数据、二阶筛查、人工智能等在NBS领域的应用,使NBS效率不断提高;(3)筛查经验的积累及上述技术的进步,筛查病种群体医学治疗效果及社会经济效益不断改善[2,3,4]。 三、新形势下NBS意义 NBS属于三级预防,已有50余年的历史,通过NBS早期诊治使患儿预后改善,生活质量提高已获得肯定。但仍有一些筛查病种的重症、早发型患儿面临早期死亡或致残。而当下遗传学检测、分析技术的飞速发展,使此类患儿通过NBS尽快获得了遗传学检测结果,凭借该结果对患儿家庭进行遗传咨询,可减少同一家庭再次孕育患儿的高风险,从而实现从三级预防到二级预防的过渡。同时,遗传学数据的积累,可帮助实现在特定人群或普通人群中携带者基因筛查从而完成此类疾病的一级预防。 四、新生儿遗传代谢病筛查流程 新生儿遗传代谢病是开展最早、最为广泛的筛查病种。具体筛查步骤为采集出生72 h的新生儿足跟血制成滤纸干血片标本,递送至筛查实验室集中检测,根据检测结果进行代谢指标分析,判断指标是否异常,得到筛查结果。对于筛查阳性者,根据严重程度,告知家长需2次复查或立即召回做血清学、酶学或遗传学检测以进一步确诊,并尽早干预治疗。整个筛查流程涉及包括相关接产机构(标本采集)、递送机构(标本递送)、检测机构(实验检测)、诊断随访机构(健康教育,随访治疗)和相应人员组成的筛查网络[1]。各环节均应做好相应的质量管理,以确保筛查患儿及其家庭获得最佳服务和预后。 五、常见筛查病种结果解读 (一)先天性甲状腺功能减低症(congenital hypothyroidism,CH) 1.概述: CH是因甲状腺激素产生不足或其受体缺陷所致的先天性疾病。多为散发性,产前诊断困难,新生儿筛查是其主要预防手段,是最早列入NBS并获得良好效价比的病种之一。中国CH患病率1∶1 347~1∶5 327,有区域差异,南高北低。按疾病转归分永久性CH及暂时性CH。国内外CH患病率有增高趋势,主要与筛查阳性切值下调使轻症CH检出增加及早产儿、低体重儿出生率增加等因素有关。 2.CH筛查中的特殊人群: 孕母有甲状腺疾病的新生儿筛查时易漏检,建议生后检测血清促甲状腺激素(thyroid stimulating hormon,TSH)加游离四碘甲腺原氨酸(free tetraiodothyronine,FT4);双胎或多胎可能存在交叉输血,若同胞中有1例阳性,其他同胞均需要一起复查;早产儿、低体重儿、重症患儿易出现假阴性,建议生后2周复查[5,6]。 3.筛查结果解读[1,5,6]: 国内、外多以TSH作为CH筛查指标。TSH高于当地筛查切值或复查仍高于切值者作为疑似CH召回,进一步查血清甲状腺功能,包括TSH、四碘甲腺原氨酸(tetraiodothyronine, T4)、FT4、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、游离三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)。根据上述指标不同异常组合可分为,(1)原发性CH:TSH升高合并FT4降低。需立即左旋甲状腺激素替代治疗。(2)高TSH血症:TSH升高而FT4正常者。其病因可能为暂时性或永久性CH或下丘脑-垂体轴延迟成熟。TSH>15 mU/L或4~6周后复查仍>10 mU/L者需治疗。(3)T4或FT4降低、TSH正常:可见于3%~5%新生儿。多见于早产儿,也可见于甲状腺结合球蛋白缺乏症,中枢性CH,迟发性TSH升高的患儿。长期使用多巴胺或大剂量糖皮质激素也可使新生儿或婴儿的TSH水平受抑制而不增高。治疗根据具体情况决定。(4)暂时性低甲状腺素血症:T4或FT4和T3或FT3减低,TSH正常,常见于早产儿。许多非甲状腺疾病患者血清中存在T4结合的抑制剂,也可能是T4降低原因之一。暂时性低甲状腺素血症多能在生后10周左右恢复正常,一般不需治疗。(5)垂体-下丘脑功能障碍:与暂时性低甲状腺素血症不同,除存在单纯T4或FT4降低外,还合并有低血糖、多尿、男孩小阴茎、视力障碍、先天性眼球震颤及胼胝体发育不良等症状与体征。(6)合并症型CH:研究报道CH合并症可高达10%,以染色体病、心血管病变多见。其甲状腺功能异常可分别以CH或高TSH血症形式出现,暂时性CH更常见,预后取决于合并症严重程度。 (二)高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia,HPA) 1.概述: HPA属于常染色体隐性遗传代谢病,根据不同酶或辅酶的缺陷,分为:(1)苯丙氨酸羟化酶缺乏症,又称苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU);(2)辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterindeficiency,BH4)缺乏症:BH4作为苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸羟化反应过程中的辅酶,其缺陷引起一组病,包括6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏症、二氢喋啶还原酶缺乏症,鸟苷三磷酸环化水解酶缺乏症、蝶呤-4α-二甲醇胺脱水酶缺乏症及墨蝶呤还原酶缺乏症等,除部分鸟苷三磷酸环化水解酶缺乏症为常染色体显性遗传,其余均属于常染色体隐性遗传病。我国HPA人群中,PKU占85%~90%,BH4缺乏症占10%~15%,但存在明显的地域差别,PKU患病率北高南低,BH4缺乏症则相反。2016年报道全国PKU平均患病率为1∶15 363。HPA是最早纳入NBS且获得良好效价比的病种之一。 2.实验室检测方法[1]: 苯丙氨酸为HPA筛查关键指标。可由以下方法获得,(1)Guthrie细菌抑制法:该方法敏感性较差,现多已不采用;(2)荧光定量法:该法定量、费时少,比细菌抑制法更敏感、有效,是国内筛查HPA的主要方法;(3)定量酶法:该方法不受样本内源荧光成分的干扰,对仪器要求低,但灵敏度相对荧光定量酶法低;(4)串联质谱法:可同时检测苯丙氨酸和酪氨酸,联合苯丙氨酸与酪氨酸比值能更有效地鉴别PKU、一过性或轻型HPA、其他氨基酸代谢病,正逐步成为主流技术。 3.筛查指标解读: (1)苯丙氨酸>120 μmol/L或合并苯丙氨酸/酪氨酸>2.0作为HPA阳性切值召回复查[7]。(2)指标明显增高或复查仍高者进入诊断流程,所有HPA均应进行HPA(包括轻度高苯丙氨酸血症、PKU)、BH4缺乏症的鉴别诊断:①尿蝶呤谱分析;②二氢喋啶还原酶酶活性检测;③BH4负荷试验;④遗传学检测:需包括PAH、BH4缺乏症所有相关基因,包括近年证实与HPA相关的DNAJC12基因。鉴于二代测序技术的快速发展,基因检测成为诊断HPA的有效手段。除遗传因素外,苯丙氨酸增高可继发于:(1)早产儿、未熟儿:HPA为一过性;(2)疾病因素;(3)其他遗传代谢病(如酪氨酸血症)等。 (三)先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenalhyperplasia,CAH) 1.概述: CAH是因肾上腺皮质激素合成过程中酶的缺陷,致肾上腺皮质类固醇合成障碍,同时经负反馈作用使雄激素生成过多的一组常染色体隐性遗传病。根据酶缺陷种类分为:21-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、17α-羟化酶缺乏症、17,20裂解酶缺乏症、3β-羟脱氢酶缺乏症、先天性类脂类肾上腺皮质增生症、11α-羟化酶缺乏症、P450氧化还原酶缺乏症,其中最常见的是21-羟化酶缺乏症,占90%~95%,国内外报道发病率1/10 000~1/20 000[8]。 2.实验室检测方法[1]: 以17羟孕酮(17-hydroxylprogesterone,17-OHP)作为CAH筛查指标,主要筛查21羟化酶缺乏症。17-OHP可由以下方法获得:(1)时间分辨荧光免疫法;(2)荧光酶免疫分析法;(3)串联质谱方法,因17-OHP筛查CAH阳性预测值较低,应用该方法测定滤纸干血片中17-OHP、11-脱氧皮质酮、皮质醇等,结合相应的比值,作为CAH的二级筛查,具有更高的特异性和灵敏度。 3.筛查指标解读[8]: (1)由于CAH筛查有较高的假阳性率,17-OHP阳性切值的合理设定是CAH筛查的关键,"CAH新生儿筛查共识"推荐17-OHP阳性切值:足月儿或正常体重儿为30 nmol/L;早产儿或低体重儿为50 nmol/L。(2)17-OHP浓度影响因素较多:孕周、出生体重与17-OHP浓度存在一定负相关;合并某些心、肺、脑病时17-OHP也会继发性增高;提前采血因17-OHP在24 h内生理性升高会出现假阳性;母亲应用某些药物亦可致假阳性。而孕母或新生儿糖皮质激素治疗史等可致假阴性,此类案例需在生后2周再次复查以免漏检。(3)出生体重和胎龄是最常见的设立17-OHP临界值的分类条件。实验室需要建立自己的临界值,可根据百分位数或根据正常范围进行确定。可疑阳性者需立即召回复查,仍阳性者进入诊断流程,通过基因检测可确诊。 (四)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏症 1.概述: G6PD缺乏症是X连锁不完全显性遗传的红细胞酶缺陷病。因G6PD基因缺陷,红细胞抗氧化能力低下,受过氧化因子攻击时易发生溶血所致。其患病率有明显地域差异,我国患病率呈南高北低,以广东、广西、海南、云南、贵州、四川等地患病率最高达4.0%~15.0%[1]。 2.实验室检测: 筛查方法主要包括,(1)荧光定量法,具有较高特异度和灵敏度,NBS推荐使用该方法。阳性切值多设定为
中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组中华预防医学会儿童保健分会新生儿疾病筛查学组前言先天性甲状腺功能减低症(congenital hypothyroidism,简称先天性甲低)是引起儿童智力发育及体格发育落后的常见小儿内分泌疾病之一,也是可预防、可治疗的疾病.由于先天性甲低患儿在新生儿期可无特异性临床症状或者症状轻微,对新生儿进行群体筛查是早期发现先天性甲低的主要方法.我国自1981年开始进行新生儿先天性甲低的筛查,目前全国筛查覆盖率已经超过60%,发病率约为1/2050。随着新生儿疾病筛查在全国范围的进一步推广,进行先天性甲低诊治的医疗机构和专科医师不断增多.为规范疾病的诊断和治疗,2010年卫生部颁布了《新生儿疾病筛查技术规范(2010版)》。本文在此规范框架基础上,针对先天性甲低的新生儿筛查、筛查结果分析、诊断和处理、随访等环节,提出进一步的操作共识。定义和病因分类先天性甲低是因甲状腺激素产生不足或其受体缺陷所致的先天性疾病,如果出生后未及时治疗,先天性甲低将导致生长迟缓和智力低下。先天性甲低的分类按照病变部分可分为原发性和继发性。原发性甲低即甲状腺本身的疾病所致。其特点为血促甲状腺激素(TSH)升高和游离甲状腺激素(FT4)降低,甲状腺先天性发育异常是最常见病因;继发性甲低病变部位在下丘脑和垂体,又称中枢性甲低,特点为FT4降低,TSH正常或下降,较为少见。另外还存在一种外周性甲低,因甲状腺激素受体功能缺陷所致,较罕见。先天性甲低按疾病转归又分为持续性甲低及暂时性甲低,持续性甲低指由于甲状腺激素持续缺乏,患儿需终生替代治疗;暂时性甲低指由于母亲或亲生儿等各种原因,致使出生时甲状腺激素分泌暂时性缺乏,甲状腺功能可恢复正常的患儿。先天性甲低的病因和分类详见表1。在新生儿筛查和临床中会发现部分患儿血TSH增高而FT4水平在正常范围,称为高TSH血症。高TSH血症的临床转归可能为TSH恢复正常、高TSH血症持续以及TSH进一步升高,FT4水平下降,发展到甲低状态。临床表现一、 新生儿期多数先天性甲低患儿出生时无特异性临床症状或症状轻微,但仔细询问病史及体格检查常可发现可疑线索,例如母亲怀孕时常感到胎动少、过产期、巨大儿,生后可出现黄疸较重或者黄疸消退延迟、嗜睡、少哭、哭声低下、纳呆、吸吮力差、皮肤花纹(外周血液循环差)、面部臃肿、前后卤较大、便秘、腹胀、脐疝、心率缓慢、心音低钝等。如果中枢性甲低合并其他垂体促激素缺乏,可表现为低血糖、小阴茎、隐睾以及面中线发育异常,如唇裂、腭裂、视神经发育不良等。二、 婴幼儿及儿童期临床主要表现为智力落后及体格发育落后。患儿常有严重的身材矮小,可有特殊面容(眼距宽、塌鼻梁、唇厚舌大、面色苍黄)、皮肤粗糙、粘液性水肿、反应迟钝、脐疝、腹胀、便秘以及心功能及消化功能低下、贫血等表现。诊断一、 新生儿筛查先天性甲低发病率高,在新生儿期多无特异性临床症状,如在临床发病后开始治疗,将影响患儿的智力和体格发育。因此,对新生儿进行群体筛查是早期发现,早期诊断的必要手段。卫生部规定新生儿先天性甲低筛查方法为足月新生儿出生72h后,7d之内,并充分哺乳,足跟采血,滴于专用滤纸片上测定干血滤纸片TSH值。该方法只能检出原发性甲低和高TSH血症,无法检出中枢性甲低、TSH延迟升高的患儿等。国际上有些国家采用T4+TSH同时筛查的方法,但是筛查成本高。由于技术及个体差异,约5%的先天性甲低患儿无法通过新生儿筛查系统检出。因此对甲低筛查阴性病例,如有可疑症状,临床医生仍然应该采血再次检查甲状腺功能。危重新生儿或接受过输血治疗的新生儿可能出现筛查假阴性结果,必要时应再次采血复查。 低或极低出生体重儿由于下丘脑-垂体-甲状腺轴反馈建立延迟,可能出现TSH延迟升高,为防止新生儿筛查假阴性,可在出生后2~4周或体重超过2500g时重新采血复查测定TSH、FT4。二、 确诊性检查测定血清FT4和TSH,FT4浓度不受甲状腺结合球蛋白(TBG)水平影响。若血TSH增高、FT4降低者,诊断为先天性甲状腺功能减低症。若血TSH增高、FT4正常,可诊断为高TSH血症。若TSH正常或降低,FT4降低,诊断为继发性或者中枢性甲低。三、 其他辅助检查1. 甲状腺B超:可评估甲状腺发育情况,但对异位甲状腺判断不如发射性核素显像敏感,甲状腺肿大常提示甲状腺激素合成障碍或缺碘。2. 甲状腺发射性核素摄取和显像:碘123(I-123)或锝99m(Tc99m)由于反射性低常用于新生儿甲状腺核素显像。需注意不要因为做此检查而推迟开始治疗时间。甲状腺放射性核素显像可判断甲状腺的位置、大小、发育情况及摄取功能。甲状腺核素摄取缺乏结合B超可以明确甲状腺缺如。甲状腺核素摄取缺乏也可见于TSHβ基因缺乏或受体缺陷、碘转运障碍或存在母源性TRB-Ab,结合甲状腺B超和血清甲状腺球蛋白、TRB-Ab检测,可对先天性甲低的病因进行进一步的分析和判断。若核素扫描提示甲状腺增大需除外甲状腺合成障碍,结合进一步的过氯酸盐排泄试验明确甲状腺碘的氧化和有机化缺陷。3. X线摄片:新生儿膝关节正位片股骨远端骨化中心出现延迟,提示可能存在宫内甲低。幼儿和儿童手腕部摄片可显示骨成熟明显延迟。4. 甲状腺球蛋白(Tg)测定:Tg可反应甲状腺组织存在和活性,甲状腺发育不良患儿Tg明显低于正常对照。甲状腺摄碘缺乏而Tg升高者提示甲状腺存在,需考虑TSH受体突变、碘转运障碍或存在母源性TRB-Ab,而非甲状腺发育不良。5. 抗甲状腺抗体测定:自身免疫性甲状腺疾病的母亲产生的TSH受体阻滞抗体可通过胎盘影响胎儿甲状腺发育和功能。5%孕龄女性患有自身免疫性甲状腺疾病,可伴有甲状腺球蛋白抗体或过氧化物酶抗体,但TRB-Ab阳性者少见。TRB-Ab可引起暂时性甲低。6. 基因学检查:仅在有家族史或其他检查提示为某种缺陷的甲低时进行,报道甲状腺发育不良者因TTF-1、TTF-2、PAX8等基因突变所致者仅占2%,多数患儿病因不明。7. 其他检查:延迟诊断和治疗的患儿需检查血常规、肝功生化、心肌酶谱、血脂;继发性甲低应做下丘脑-垂体部分核磁共振(MRI)及其他垂体激素检查。治疗无论是原发性或者继发性先天性甲低,一旦确定诊断应该立即治疗。对于新生儿筛查初次结果显示干血滤纸片TSH值超过40mU/L,同时B超显示甲状腺缺如或发育不良者,或伴有先天性甲低临床症状与体征者,可不必等静脉血检查结果立即开始左旋甲状腺素钠(L-T4治疗)。不满足上述条件的筛查阳性新生儿应等待静脉血检查结果后再决定是否给予治疗。治疗首选L-T4,新生儿期先天性甲低初始治疗剂量10~15ug/(kg*d),每日一次口服,尽早使FT4、TSH恢复正常,FT4最好在治疗两周内,TSH在治疗4周内达到正常。对于伴有严重先天性心脏病患儿,初始治疗剂量应减少。治疗后2周抽血复查,根据血FT4、TSH浓度调整治疗剂量。在随后的随访中,甲状腺激素维持剂量需个体化。血FT4应维持在平均值至正常上限范围之内,TSH应维持在正常范围内。L-T4治疗剂量应随静脉血FT4、TSH值调整,婴儿期一般在5~10ug/(kg*d),1~5岁5~6ug/(kg*d),5~12岁4~5 ug/(kg*d),药物过量患儿可有颅缝早闭和甲状腺功能亢进表现,如烦躁、多汗等,需及时减量,4周后再次复查。对小婴儿,L-T4片剂应压碎后在勺内加少许水或奶服用,不宜置于奶瓶内喂药,避免与豆奶、铁剂、钙剂、消胆胺、纤维素和硫糖铝等可能减少甲状腺素吸收的食物或药物同时服用。对于TSH大于10mU/L,而FT4正常的高TSH血症,复查后TSH仍然增高者应给予治疗,L-T4起始治疗剂量可酌情减量,4周后根据TSH水平调整。 对于TSH始终维持在6~10mU/L的婴儿的处理方案目前仍存在争议,在出生头几个月内TSH可有生理学升高。对这种情况的婴儿,需密切随访甲状腺功能。 对于FT4和TSH测定结果正常,而总T4降低者,一般不需治疗。多见于TBG缺乏、早产儿或者新生儿有感染时。 对于幼儿及年长儿下丘脑-垂体性甲低,L-T4治疗需从小剂量开始。如伴有肾上腺糖皮质功能不足者,需同时给予生理需要量皮质素治疗,防止突发性肾上腺皮质功能衰竭。如发现其他内分泌激素缺乏,应给予相应替代治疗。随访需定期复查患儿血FT4、TSH浓度,以调整L-T4治疗剂量。治疗后2周首次进行复查。如有异常,调整L-T4剂量1个月复查。1岁内每2~3个月复查1次,1岁以上3~4个月复查1次,3岁以上6个月复查一次,剂量改变后应在1个月后复查,并同时进行体格发育评估。部分高TSH血症患儿在随访过程中可发现FT4增高,需逐步减少服用的L-T4剂量,直至停药观察。先天性甲低伴甲状腺发育异常者需终生治疗,其他患儿可在正规治疗2~3年尝试停药1个月,复查甲状腺功能,甲状腺B超或者甲状腺放射性核素显像。治疗剂量较大的患儿如果停药检查,可先减半量,1个月后复查。如TSH增高或伴有FT4降低者,应给予甲状腺终生治疗。如甲状腺功能正常者为暂时性甲状腺功能减低症,继续停药并定期随访1年以上,注意部分患儿TSH会重新升高。预后开始治疗的时间早晚、L-T4初始剂量和3岁以内的维持治疗依从性等因素与患儿最终智力水平密切相关。新生儿筛查患儿应尽早开始治疗,及时纠正甲低状态,以避免出现中枢神经系统损害。先天性甲低患儿如能在出生2周内开始足量治疗,大部分患儿的神经系统发育和智力水平可接近正常。新生儿筛查发现的甲低患儿,经过早期治疗,预后多数良好。晚发现、晚治疗者的体格发育有可能逐步赶上同龄儿童,但神经、精神发育迟缓不可逆。严重的先天性甲低患儿,即使早期治疗者,仍有发生神经系统后遗症。部分治疗延迟者即使智力发育落后不明显,也有可能存在程度不等的听、说、操作以及认知反应方面的缺陷。 参与本指南撰写者(以姓氏笔画为序) 刘戈力、邱文娟、顾学范、熊丰 参与本指南审定者(以姓氏笔画为序) 孔元原、叶军、刘丽、巩纯秀、江剑辉、张立琴、张知新、张惠文、李桂梅、李堂、李嫔、杨玉、杨茹莱、杨艳玲、韩连书、邱文娟、陈少科、周卉、罗小平、罗飞宏、赵正言、梁黎、傅君芬
先天性甲状腺功能减低症(CH)是指出生时就出现的甲状腺激素缺乏的疾病。是儿童最常见的引起智力落后的内分泌疾病。我国发病率约为1/2000。女性多于男性,女/男为2:1。由于新生儿甲低可无临床症状及症状轻微,对新生儿进行群体筛查是尽早诊断先天性甲低的重要手段。自我国开始了CH新生儿疾病筛查,目前全国每年超过50%的新生儿接受甲低的筛查。临床表现多数先天性甲低出生时临床表现轻微或无临床症状,这与母体甲状腺激素通过胎盘而起到的保护作用有关。新生儿甲低的临床症状体征不典型,多数症状轻微。临床表现有过期产,巨大儿,哭声嘶哑,昏睡,喂养困难,便秘,黄疸延迟,肌张力低,少动后囟未闭,鼻梁低,鼻周、唇周发绀,巨舌,毛发多,脐疝,皮肤干燥、发花,末梢循环差, 少数可有甲状腺肿大。诊断 1.血滤纸片的先天性甲低新生儿筛查我国先天性甲低的新生儿疾病筛查方法为收集生后3天新生儿全血于干血滤纸片上并测定TSH水平。该方法利于检出原发性甲低和高TSH血症,但对中枢性甲低、TSH延迟升高患儿会被漏诊。2.确诊性血清甲状腺激素检查测定血清FT4(或总T4)和TSH。若血TSH增高,FT4降低者,诊断为先天性甲状腺功能减低症。若血TSH增高,FT4正常者,诊断为高TSH血症。若TSH正常或降低,FT4降低,诊断可能为继发性或中枢性甲低。3.其他相关检查1) 甲状腺核素摄取和扫描2)甲状腺B超:可准确评估甲状腺发育情况及有无甲状腺肿大,但对异位甲状腺判断不如核素扫描敏感。甲状腺肿大常提示甲状腺激素合成障碍疾病。3) X线摄片:新生儿膝关节正位片股骨远端骨化中心出现延迟,提示可能宫内存在甲低治疗 患儿开始治疗的时间、剂量和2-3岁以内的维持治疗情况与其最终智力水平密切相关。尽快使血FT4和TSH恢复至正常范围,一般选用左旋甲状腺激素(L-T4)治疗。治疗开始时间应尽早。初始L-T4治疗剂量10-15μg/kg.d(约37.5~50μg/d),应在治疗2周后使FT4和TSH达到正常范围。 根据新生儿筛查结果新生儿出现超过2项的临床表现,或有股骨远端骨化中心延迟,干血滤纸片筛查TSH值明显升高(TSH初次筛查值超过30mU/L),不必等静脉血检查结果就应当立即开始L-T4治疗。若甲状腺B超发现无甲状腺或发育不良也应立即开始治疗。不满足上述这些条件的筛查阳性新生儿应等静脉血检查结果后决定是否给予治疗。 对于出生2周后FT4正常而TSH高于10mU/L的患者,多数小儿内分泌医师认为应接受治疗。对未接受治疗者,应每2-4周复查FT4、TSH观察变化趋势,如FT4或和TSH仍有异常则应尽快开始治疗。对于出生后1月内TSH始终维持在6-10mu/l的婴儿的处理方案目前仍存在争议,对这种情况的婴儿,需密切随访甲状腺功能。 要求天规律性服药,对小婴儿,L-T4片剂应压碎后在勺内加入少许水或奶服用,不能置于奶瓶内喂药,避免与豆奶、铁剂、钙剂、消胆胺、纤维素和硫糖铝等可能减少LT4吸收的食物或药物同时服用。 之后的随访L-T4维持剂量个体化,根据血FT4、TSH浓度调整。血FT4应维持在平均值至正常上限范围之内,TSH应维持在正常范围内。甲状腺发育不良、异位者需要终身治疗,其他患儿可在正规治疗2~3年停药1个月,如TSH增高或伴有FT4降低者,应给予L-T4终身治疗;如甲状腺功能正常者为暂时性甲状腺功能减低症,停药并定期随访,部分患者会TSH重新升高。如果出现TSH重新升高,需要再次开始治疗。
近年来,随着生活水平的提高,家长对孩子生长发育的关注度越来越高,许多家庭给孩子服用各种补品,来医院看性早熟门诊的患者逐渐增多。外国一些研究报告显示,儿童性早熟或许和现代的饮食方式偏向于高脂肪、高蛋白质等有关,是营养过剩或超重所导致。正常情况下,通常女孩在9-10岁多时才会出现第二性征发育,如乳房发育、阴毛生长、来月经等等。男孩则在12岁左右时开始出现睾丸发育、胡须生长等第二性征。女孩在8岁前出现乳房发育,男孩在9岁以前出现睾丸发育的特征,就属于性早熟,需要就医。来医院就诊的患者中,实事上很大部分仅表现为乳房发育,而没有其他性早熟特征,如生长加速,性腺增大,骨龄超前等。这部分患者大多不是真正的“性早熟”,是由于一过性的卵巢功能活动或对雌激素的敏感性提高造成的,又称单纯性乳房发育,但它也可能是真正性早熟的前期表现,以后逐渐过渡为真正的性早熟。造成真正的性早熟的一个可能因素,是脑部中枢神经系统的垂体和下丘脑提早释放性促性腺激素所导致,这称为“真性性早熟”。性早熟也会基于由外周来源的性激素过早分泌所导致,这称为“假性性早熟”。 另外,也有较为罕见的情况,如肿瘤导致性早熟,肿瘤的生长部位包括在脑部位,或是其他分泌激素的器官。女孩中的性早熟有70%-80%是不明原因的、体质性的,而男孩中50%以上都是可以找到病因的如脑部肿瘤等。儿童性早熟可使儿童产生心理行为和体格发育两方面的危害。患者可能因自己在体型、外表上与周围小伙伴不同,而产生自卑、恐惧和不安。女孩过早来月经往往影响其正常生活和学习。男孩会出现早恋倾向及过早的性行为。由于性早熟儿童往往伴有骨骼生长的加速,虽然暂时看起来比别人长得快,却提早把以后要长的部分用掉了,超前的越多,身高生长停止得越快,长大后反而会矮人一截。绝大多数性早熟可以治好,但早期发现、及时治疗非常重要。只要提早发现和及时治疗,性早熟的患者可以获得正常的心理状态及期望达到的成人期身高,且越早治疗效果越好。如何尽早发现孩子性早熟呢?除日常生活中多留心观察孩子是否有第二性征过早以外,10岁以前孩子身高增长突然加速往往是性早熟的一个信号,此时家长不应盲目乐观。如怀疑孩子有这方面的问题时,家长应及时带孩子去医院咨询、就诊,以免错过最佳治疗时机。如果女孩等到月经来潮,男孩等到已出现变声、喉结、痤疮才开始治疗,则对改善身高来说为时已晚。
中华儿科杂志,2005,43(5):325-330韩连书,高晓岚,叶军,邱文娟,顾学范[摘要] 目的 应用串联质谱技术通过检测干血滤纸片中的酰基肉碱谱,对遗传性代谢病高危儿童进行有机酸血症筛查和诊断研究。 方法 遗传性代谢病高危儿童1000例,男642例,女358例,年龄中位数为2岁(5天~15岁), 手指采血,滴于滤纸片上。取直径为3 mm的干血滤纸片放入96孔聚丙烯板,经含酰基肉碱内标的甲醇萃取,盐酸正丁醇衍生后,进行串联质谱分析。结果 在1000例高危儿童中筛查并诊断有机酸血症40例(4.0%),其中甲基丙二酸血症20例,丙酸血症6例,异戊酸血症3例,戊二酸血症I型3例,戊二酸血症II型3例,3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症1例,3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症1例,生物素酶缺乏症2例,b-酮硫解酶缺乏症1例。患者临床表现主要为运动和智力发育落后、抽搐、意识障碍、肌张力低下、呕吐和喂养困难等。常规实验室检查主要表现为酸中毒、高血氨、高乳酸血症和低血糖等。结论 串联质谱技术能够通过检测血滤纸片中的不同酰基肉碱浓度,对部分有机酸血症进行快速筛查和诊断,结合尿气相色谱/质谱技术,有助于提高有机酸血症诊断的准确性。【关键词】 串联质谱;有机酸血症;酰基肉碱;遗传性代谢病Application of Tandem Mass Spectrometry in diagnosis of organic acidemias HAN Lian-shu, GAO Xiao-lan, YE Jun, QIU Wen-jun, GU Xue-fan. Department of Pediatric Endocrinology, Genetic and Metabolism, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute for Pediatric Research, Shanghai 200092, China [Abstract] Objective The diagnosis of organic acidemias is very difficult and need special test methods. Recently the tandem mass spectrometry had been used in screening and diagnosis of the inborn error of metabolism. The aim of the present study was to utilize a dry blood filter paper method for acylcarnitines profiles test using tandem mass spectrometry in diagnosis of organic acidemias in high risk children. Method One thousand patients (642 were males and 358 females) with high risk of inborn error of metabolism were studied, The median of their age is 2 years. The blood was collected on filter paper, punched and extracted into methanol solution with stable isotope labeled internal standards of acylcanitine, then derivatized with butanolic-HCI. After preparation, the samples were analyzed by tandem mass spectrometry. The volume of the acylcanitines was calculated by the special software. Results Forty patients (4.0%) were diagnosed as organic acidemias among the 1000 patients, including 20 methylmalonic acidemia, 6 propionic acidemia, 3 isovaleric acidemia,3 glutaric acidemia type I, 3 glutaric acidemia type II, 2 biotinidas deficiency, 1 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency,1 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency, and 1 beta-keto thiolase deficiency. The common clinical symptoms and signs of these patients were developmental and mental retardation, spasm, lethargy, coma, hypotonia, vomiting, and feeding difficult. Routine laboratory tests were suggested by metabolic acidosis, hyperammonemia, hyperlactonemia, hypoglycemia, anemia liver function abnormal. Conclusion An apart of organic acidemias can be fast diagnosed by tandem mass spectrometry through acylcarnitine profiles analysis in dry blood filter paper. The fast and accurate diagnosis of organic acidemias by tandem mass spectrometry will be rise by combine the gas chromatography mass spectrometry.[Key words] tandem mass spectrometry; organic acidemias; acylcarnitine; inborn error of metabolism有机酸血症主要是由于氨基酸、脂肪酸和糖代谢异常导致中间代谢产物-有机酸增加,而引起一系列病理生理改变和临床症状的一组疾病,由于患者尿中含有大量有机酸又称为有机酸尿症。我国以往由于检查条件的限制,有机酸血症诊断较困难,许多患者不能得到及早的诊断和治疗。气相色谱/质谱技术为有机酸尿症的诊断提供了条件。近几年发展的串联质谱新技术,通过快速检测血中酰基肉碱谱,为有机酸血症的筛查和诊断提供了新方法[1,2]。我们在国内率先开展串联质谱新技术进行遗传性代谢病的筛查和诊断[3],现报告2003年1月~2004年10月1000例临床高危儿童有机酸血症筛查的结果和体会。对象与方法一、对象临床疑似遗传性代谢病高危儿童1000例,分别来自上海、北京、广州、香港、澳门等全国20余个省、市、特区的55所医院,其中男642例,女358例,年龄中位数为2岁(5天~15岁)。健康儿童780例,来自托儿所和幼儿园,男489例,女291例,平均年龄7岁。通过检测健康儿童的血酰基肉碱水平确定本实验室的正常上限值。所有检测均取得家长的知情同意。高危儿童临床表现包括反复呕吐、抽搐、昏迷或嗜睡、智力运动发育落后、生长发育迟缓、肌张力异常和肝脾肿大等,常规实验室检查提示有代谢性酸中毒、低血糖、高血氨、高乳酸血症等,均是原因不明者。标本采集用干血滤纸片法,手指采血或静脉抽血,滴于专用采血滤纸(S&S 903#)上,晾干后送检。二、试剂、材料和仪器1. 试剂:甲醇、盐酸正丁醇(3 mol/L)、乙腈和氮气。盐酸正丁醇(3 mol/L)由正丁醇和乙酰氯按9:1(v:v)配制。同位素内标:选用8种酰基肉碱的同位素内标对样品中20余种酰基肉碱进行定量,所有内标均购自美国剑桥同位素实验室,包括2H9-游离肉碱(2H9-carnitine, 2H9-C0),2H3-乙酰肉碱(2H3-acetylcarnitine,2H3-C2),2H3-丙酰肉碱(2H3-propionylcarnitine,2H3-C3),2H3-丁酰肉碱(2H3-butyrylcarnitine,2H3-C4),2H9-异戊酰肉碱(2H9-isovalerylcarnitine,2H9-C5),2H3-辛酰肉碱(2H3-octanoylcarnitine,2H3-C8),2H9-肉豆蔻酰肉碱(2H9-myristoylcarnitine,2H9-C14),2H3-棕榈酰肉碱(2H3-palmitoylcarnitine,2H3-C16)。上述同位素内标用甲醇稀释成工作液,4°C冰箱保存,1个月内用完。2. 材料:96孔聚丙烯板,96孔过滤板(滤膜孔径0.45 mm)购自Millipore公司。3. 仪器:串联质谱仪(API 2000型)购自美国生物应用系统公司(Applied Biosysterms),高效液相仪采用美国安捷仑公司(Agilent 1100)产品。三、测定方法1.样品处理:参考 [3, 4]报道的方法,取直径3 mm的干滤纸血片(相当于3.2 ml全血),置于96孔过滤板中,每孔加入含酰基肉碱内标的甲醇溶液100 ml,室温放置20 min,萃取血片中的酰基肉碱,然后离心至另一个96孔聚丙烯板,50°C加热吹干,再加入60 ml盐酸正丁醇(3 mol/L),Teflon 膜覆盖,置65°C恒温箱内15 min,随后50°C加热吹干,再加入80%乙腈100 ml溶解,铝膜覆盖,即可上样检测。2.仪器设置 流动相采用80%乙腈,四元泵流速设置为30 ml/min,自动进样器设置为每次进样20 ml。酰基肉碱测定采用母离子扫描方式,子离子质荷比(m/z)为 85,扫描范围为m/z 210~m/z 502,一个样品测试约需时间2.5 min。3.资料分析 定量分析采用软件ChemoView 1.2版本 (美国应用生物系统公司),根据各种丁酯化的同位素内标和酰基肉碱的离子峰强度,由已知浓度的内标,自动计算出所测样品中酰基肉碱的浓度。质控样品采用美国疾病控制和预防中心(CDC)新生儿筛查质控部门提供的串联质谱酰基肉碱血滤纸片。四、有机酸血症的诊断有机酸血症患者在有机酸代谢途经发生障碍时导致其中间代谢产物增加,包括不同种类的酰基肉碱增高。各型有机酸血症的诊断依据串联质谱特异性酰基肉碱谱的改变,结合尿气相色谱/质谱有机酸分析、临床表现和常规实验室检查等确定。结 果一、筛查结果在1000例高危儿童中确诊有机酸血症40例(4%),见表1。其中甲基丙二酸血症(Methylmalonic Acidemias,MMA)最多(50%),其次为丙酸血症(Propionic Acidemia,PA,15%)、异戊酸血症((Isovaleric Acidemia,IVA, 7.5%)、戊二酸血症(Glutaric Acidemia,GA)I型和II型(各7.5%)、生物素酶缺乏症(5%)、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症(3-Methyl Crotonyl-CoA Carboxylase Deficiency, 3-MCC)、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA Lyase Deficiency, 3-HMC)及b-酮硫解酶缺乏症各1例。表1列出了不同有机酸血症对应的串联质谱检测参数(不同种类的酰基肉碱),以及这些参数的正常儿童上限值和患儿的检测值。表1 高危儿童有机酸血症串联质谱筛查结果疾病 n 异常标志 浓度 正常上限值 (%) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L)甲基丙二酸血症 20(50) C3 11.24 5.00 C3/C0 0.58 0.20 C3/C2 1.34 0.30丙酸血症 6(15) C3 39.84 5.00 C3/C0 1.20 0.20 C3/C2 2.23 0.30异戊酸血症 3(7.5) C5 2.53 0.40戊二酸血症1型 3(7.5) C5DC 2.14 0.15戊二酸血症2型 3(7.5) 多种酰基肉碱增高3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症 1(2.5) C5-OH 2.42 0.603-羟-3-甲基戊烯二酰辅酶A裂解酶缺乏症 1(2.5) C5-OH 3.79 0.60生物素酶缺乏症 2(5.0) C3 8.75 5.00 C3/C0 0.18 0.20 C3/C2 0.31 0.30 C5-OH 5.50 0.70b-酮硫解酶缺乏症 1(2.5) C5-OH 2.31 0.70 C5:1 0.63 0.05注:C3为丙酰肉碱,C5为异戊酰肉碱,C5DC为戊二酰肉碱,C5-OH为3-羟基异戊酰肉碱,C5:1为异戊烯酰肉碱从表中可以看出患儿的检测值高于正常上限值数倍,甚至10余倍。MMA和PA患者均为丙酰肉碱(Propionylcarnitine,C3)增高,两者比较丙酸血症增高更显著(t=6.110, P<0.001)。另外,pa患者血甘氨酸(glycine,gly)增高(614< font="">±220)mmol/L(正常上限值<400 mmol/L),MMA患者Gly平均浓度在正常范围(243±123)mmol/L,两者比较差异显著(t=5.231, P<0.001)。生物素酶缺乏症表现为c3和3-羟基异戊酰肉碱(3-hydroxyisovlerylcartine,c5-oh)增高,以5-oh增高显著。3-mcc和3-hmg均为c5-oh增高。< font="">正常儿童和PA、MMA、IVA、GAI患儿的串联质谱图见图1,不同疾病相对应参数的离子峰强度显著增高,与定量结果一致,PA和MMA均表现C3离子峰强度增高,PA患儿C3增高更显著。二、临床资料分析40例有机酸血症儿童中男23例,女17例,年龄20天~15岁,发病年龄1天~15岁,诊断年龄1个月~15岁,发病至诊断明确间隔时间23天~11年。其中34例患儿临床资料较完整,智力落后14例(41.2%),抽搐10例(29.4%),意识障碍(嗜睡或昏迷)11例(32.4%),运动落后22例(64.7%),肌张力低下14例(41.2%),步态不稳3例(8.8%),呕吐13例(38.2%),喂养困难2例(5.9%),肝脾肿大2例(5.9%),肌肉疼痛1例(2.9%)。家族史阳性3例(8.8%),其中2例MMA患儿的姐姐已明确诊断为MMA,1例MMA患儿的同胞中有不明原因的夭折史。常规实验室检查显示高乳酸血症17例(50%), 酸中毒11例(32.4%), 尿酮体阳性8例(23.5%),高血氨7例(20.6%),肝功能异常6例(17.6%),贫血5例(14.7%),肌酸激酶增高5例(14.7%),低血糖4例(11.8%),头颅CT或核磁共振检查异常8例(23.5%),表现为不同形式的脑损害。 讨 论有机酸是氨基酸、脂肪酸、类固醇、碳水化合物或者某些药物在体内代谢的中间产物,由于代谢途经中某种酶的缺陷,导致其中间代谢产物和旁路代谢产物的增加,形成有机酸血症。在代谢过程中大部分有机酸需与辅酶A结合成酰基辅酶A才能逐步代谢,有机酸血症时同时导致大量酰基辅酶A的累积,酰基辅酶A与肉碱结合形成酰基肉碱,辅助有机酸的排出,所以患者体内相对应的酰基肉碱大量增加[5]。由于血中酰基肉碱属微量物质,结合其结构的特点,常规的实验室方法较难测定。既往有机酸血症的诊断常常依靠培养外周血白细胞或皮肤成纤维细胞酶活性测定,难于广泛应用,目前临床主要采用尿液气相色谱/质谱有机酸分析方法进行诊断。串联质谱技术将被测物质分子电离成各种质荷比不同的带电粒子,由一级质谱(MS1)选择一定质量的离子进入碰撞室产生子离子或中性分子,再经过二级质谱(MS2)检测,通过母离子与子离子或中性分子配对分析,显著提高了方法的特异性和灵敏性[6]。对于有机酸血症,串联质谱主要通过检测血液中不同的酰基肉碱的浓度进行筛查和诊断。Wilcken等[7]报道澳大利亚利用串联质谱进行新生儿遗传代谢病筛查后有机酸血症患病率较以前显著增加。本研究利用串联质谱技术,在高危儿童中有机酸血症的阳性率为4.0%。与气相色谱/质谱检测遗传性代谢病高危儿童相比较,国内杨艳玲报道阳性率为4.2%[8],罗小平为3.7%[9],巴西Wajner报道为4.2% [10],串联质谱技术与气相色谱/质谱技术对有机酸的检测阳性率比较接近。病种方面以MMA最多(50%),其次为PA(15%),与国内及其他国家结果一致[8, 10, 11],至于IVA、GA-I和GA-II型等所占比例有所不同,可能与所用检测方法的不同有关。根据有机酸血症的发病机制,串联质谱技术对于某些有机酸血症可明确诊断,例如, C5显著增高可诊断IVA, C5DC单独增高可诊断GA-I型,多种酰基肉碱增高可诊断GAII型(又称为多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症),甲基丙二酰肉碱(C4DC)和C3均增高可诊断MMA,C5-OH和C3均增高可诊断多种羧化酶缺乏症。部分有机酸血症串联质谱分析可表现为同一种酰基肉碱增高,如PA和MMA均为C3增高,本研究诊断为MMA的20例高危儿童,C4DC均正常。但根据发病机制由于PA直接引起C3增高,而MMA间接引起C3增高,所以理论上PA时C3增高更显著,这在本研究串联质谱的C3检测结果中得到证实,与Chace等[12]报道的一致。我们观察到C3大于30 mmol/L基本可排除MMA,诊断为PA,小于15 mmol/L基本可排除PA,诊断为MMA,C3介于15~30 mmol/L之间需进行尿有机酸分析进行鉴别。至于MMA患者C4DC不增高的原因可能与甲基丙二酰辅酶A不易与肉碱结合有关。虽然生物素酶缺乏症或多种羧化酶缺乏症也有C3增高,但同时伴有C5-OH增高,且以C5-OH增高为主,C3/C0和C3/C2正常,而MMA和PA 患者C3/C0和C3/C2显著增高,故易与PA或MMA鉴别。对于3-MCC、3-甲基戊烯二酰辅酶A 水解酶缺乏症和3-HMC串联质谱分析均表现为C5-OH增高,且增高的程度无显著差别,故单用串联质谱仅可提示为这三种疾病中的一种,不能确定是哪一种疾病,需要进行尿气相色谱/质谱分析进行鉴别。Koeberl报道[13]利用串联质谱技术在美国北佛罗里达州筛查出的8例C5-OH增高的新生儿,均确诊为3-MCC,表明在这三种疾病中,3-MCC的发病率可能较高。当然,尿液气相色谱/质谱分析对有机酸血症检测有其优点,但不足之处为标本处理成本高,分析时间较长,不适合大规模常规筛查。利用高灵敏、快速的串联质谱分析血酰基肉碱的优点,结合进一步的尿气相色谱/质谱分析,可使有机酸血症的诊断更加快速、准确。从本文患儿的临床和常规实验室检查结果分析来看,单靠临床症状和常规实验室检查不能够确定有机酸血症,当遇到原因不明的运动、智力发育落后、抽搐、意识障碍和肌张力低下等神经系统表现,或者有呕吐、喂养困难和肝脾肿大等多脏器损害的症状体征,在实验室方面有酸中毒、高血氨、高乳酸血症、低血糖、肝功能异常、贫血和酮症,或者头颅CT、核磁共振表现为不同形式的脑损害时,应考虑到有机酸血症或其他遗传性代谢病的可能,留取血样或尿样送到能够进行酰基肉碱、有机酸和氨基酸分析的实验室进行特异性检测。这样可及早诊断,及早治疗,避免或减轻不可逆的病理改变。本研究中患儿发病时间在1岁之内的占83.3%,而1岁内得到确诊的只占33.3%,明确诊断距发病时间超过1年者达45.8%。说明大部分患儿未能在发病后较短的时间内得到确诊和正确的治疗,导致在明确诊断时已出现不可逆的神经系统发育异常,其中2例患儿因病情已较重,在明确诊断后不久死亡。可见对于高危患儿进行特殊的检查非常重要。综上所述,串联质谱技术是检测有机酸血症的又一项新技术,该技术还能够同时对多种氨基酸代谢病和脂肪酸氧化障碍进行筛查和诊断,结合其检测速度快的优点,在一些发达国家已广泛应用于新生儿遗传代谢病的筛查,提高了筛查质量,提高了遗传代谢病的诊治水平。本研究为串联质谱技术在国内的应用和推广提供了经验。